Futbola 17 yaşında, River Plate takımında başladı. River Plate ile 6 lig şampiyonluğu kazandı. 1949′da Arjantin'deki futbolcu grevinden sonra, kulübü River Plate'ten ayrılıp Kolombiya ekibi Club Deportivo Los Millionarios'a gitti. 1953 yılında Millonarios takımının formasını giyerken Avrupa turnesi sırasında Real Madrid'li ve Barcelona'lı yöneticilerin dikkatini çekti ve Santiago Bernabéu Yeste, neredeyse di Stefano'nun transferini bitirecek olan Barcelona'dan önce davranarak onu takımına getirdi.1953 - 1964 arasında giydiği Real Madrid formasıyla 8 La Liga, 1 Copa del Rey, 5 Avrupa Şampiyon Kulüpler Kupası ve 1 Kıtalararası Kupa şampiyonluğu kazandı. 11 yılda takımına toplam 308 gol kazandırdı. Yine aynı sürede 58 Avrupa kupası maçında attığı 49 gollük rekor ancak 2005 yılında Raúl González tarafından kırılabildi. 1957 ve 1959 yıllarında Ballon d'Or'nü kazandı. 6 kez Arjantin millî takımının, 4 kez de Kolombiya millî takımının formasını giydikten sonra İspanyol vatandaşlığına geçip 31 defa da bu ülkenin formasını giydi. 1966'da 40 yaşındayken Espanyol formasıyla futbol yaşamını noktaladı. Brezilyalı ünlü futbolcu Pele, 2009 Eylül ayında yaptığı basın açıklamasında Di Stefano'nun dünyanın gelmiş geçmiş en iyi futbolcusu olduğunu belirtmiştir.Alfredo Di Stéfano Golcülüğü, liderliği ve oyun zekasıyla futbol tarihine adını altın harflerle yazdırdı.