Empoli genç takımında 1994 yılından itibaren forma şansı bulan Di Natale, profesyonel kariyerine Empoli A takımı ile 1996 yılında başladı. 2004 yılına kadar kulüpte kaldı. Bu süre zarfında, Iperzola, Varese ve Viareggio takımlarına kiralık olarak verildi.2004 yılında yükselen performans ve başarılarıyla Empoli'den Udinese'ye transferi gerçekleşti. Udinese formasıyla çıktığı maçlarda kabiliyetleri ve liderlik görevini başarıyla sergilemesinden dolayı kulüp, ligi en iyi 5 sırada bitiren kulüpler arasına girmeyi başardı. 2007 yılına gelindiğinde Di Natale takım kaptanı olarak görev yapmaya başladı.2010 ve 2011 yıllarında Serie A gol krallığı ödülüne layık görüldü ayrıca Serie A Yılın İtalyan Oyuncusu ödülünü de 2010 yılında gösterdiği performans ile kazandı.Antonio Di Natale aynı zamanda Serie A'da 2009/2010 sezonunda 29, 2010/2011 sezonunda 28 golle gol kralı olmuştur. Natale, 15 Mayıs 2016'da futbol kariyerini Udinese'da noktalamıştır.